光片显微成像技术（Lightsheet Microscopy）可以说是继共聚焦显微技术和双光子显微技术后，成为当下生物医学最 in 的成像技术。通过将样本透明化，可实现对完整器官的整体三维成像。对于这门成像技术，小旎会分期推出光片成像小课堂，将光片扫描成像技术的基本原理、参数含义及实操方法、技巧介绍给大家，希望帮助大家突破光片成像的入门门槛，让该技术成为研究的常见研究手段。

今天是光片成像小课堂的第一讲，帮助大家了解光片成像的基本知识。其后将介绍两篇基于透明化骨并使用 LaVision UltraMicroscope 光片显微镜发表的最新研究进展。
 
✦光片是如何形成的？

当点状激光束投射到柱面透镜, 透射光就可聚焦形成线状光束，即光片。可以通过一个简单有趣的实验帮你理解光片的形成，只需要借助一支 15 ml 的离心管、一支激光笔和一面白墙。

将激光笔发出的光透过离心管管身投射到墙上，此时的透射光仍为点状激光；若将离心管内注满水后再次重复以上动作，你会观察到此时透射到墙面上的光成为线状，这就是柱面透镜形成光片的基本原理。
✦光片扫描

如下图所示，将样本以横截面与光片平行的方向置于光片的照射区域，通过上下移动样本，完成整体三维成像。我们把与光片垂直，也就是样本上下贯穿光片的方向定义为 Z 轴方向，请记住这个 Z 方向，它在光片扫描中至关重要。
✦光片的聚焦

柱状透镜的光学特性决定了经其投射形成的光片呈中央平窄并向两侧扩散增厚的形态，即光片厚度存在极大的差异性。因此，光片聚焦的过程就是 Z 轴聚焦以优化该方向分辨率的过程。光学上把光片最薄的中央「腰」部的厚度定义为 w0, 此时 x 轴向的位置定义为 0；当 w 随 X 轴的位置改变而增加到 40% 时，X 轴向距离被称作 Rayleigh 长度。光学上认为，只有 2x Rayleigh 长度范围内是可以实现 Z 轴方向聚焦，从而达到高分辨率图像的。
✦光片的分辨率

显微技术的核心就是提高分辨率，在这个领域中，不得不提的概念就是数值孔径 (Numerical Aperture, NA），它决定了显微镜收光能力和空间分辨率：高数值孔径的透镜比低数值孔径者具有更高的分辨空间细节的能力，但景深会减弱。如下表格能更直观理解改变 NA 数值对成像结果的影响。

骨组织蕴藏了独特的且关键的生理机制，如造血、增生和损伤后的修复、重塑等。然而受限于骨的特殊结构和现有实验方法，只能采用切片的方法。切片法在帮助科学家获取骨组织内部细胞水平信息的同时也破坏了原有样本，且令骨髓及骨内膜血管、神经等管网状连贯结构的研究变成了「不可能的任务」。虽然可以采用 MRI 的进行整体扫描，但所得数据包含的生物学信息及其分辨率极低下。

近日，分别来自北京大学和德国杜伊斯堡-埃森大学的两个课题组，分别报道了全新的骨透明化方法；通过光片扫描三维成像方法，获得了突破性发现且文献分别发表在 Cell Research 和 Nature Metabolism 杂质上，充分展示了光片扫描成像的强大功能。
 
继 6 月 25 日在 Cell 子刊报道了基于透明化脾脏观察到特殊花序状交感神经在抗感染中发挥重要作用的研究后，近日，北京大学杨竞课题组又发表新研究了！

杨竞课题组开发了一种名为 BoneClear 的骨透明技术，应用该技术可成功将小鼠的股骨、脊柱进行透明化的同时兼容免疫荧光染色，而且与以往可对骨透明度加以改善的 Bone CLARITY 相比，不引起组织体积的改变。几张图充分说明如此过硬的透明化技术：

• 通过使用 PGP9.5 这一泛神经元标记物进行特异性标记，3D 成像揭示出位于股骨骨髓内的神经网络结构，这是之前从未被报道的发现；
• 在使用多巴胺能神经元特异标记物进行标记后，首次观察到位于股骨内神经支配的存在，且主要是由交感神经支配的；

 

• 在系统给予化疗药物诱导神经病理损伤模型后，可观察到骨内支配神经的显著缺损。

 
另外一项关于骨的突破研究是由德国杜伊斯堡-艾森大学的 Hasenberg 和 Gunzer 两家实验室合作发表的，揭示骨髓内及骨髓-骨膜血液循环的新学说，同时展示了中性粒细胞被动员后从骨髓迁出的情景。

中性粒细胞（Neutrophils）在维持机体抵御感染和维持免疫环境稳态发挥重要的作用。成熟的中性粒细胞不能增殖，在有炎症发生时，仅能在血液中存活至多 6 个小时即被招募至损伤或炎症区域，1-2 天后走向凋亡。因此作为机体免疫的第一道防线，中性粒细胞依靠持续大量的生成和成熟，以维持其数量和功能上的稳态。比较公认的数据认为，一个成年人每天骨髓来源新生的中性粒细胞数量在 10¹¹ 数量级。

中性粒细胞来源于骨髓，由髓样前体细胞成熟而来，并在 G-CSF(集落刺激因子) 等动员剂作用后，于 2 小时内迅速由骨髓迁移入血。那么问题来了，是怎样的作用机制和物理结构，令中性粒细胞及时获得刺激信号并迅速响应进入外周血循环的？

早年的多项研究已经观察到在系统给予 G-CSF 后，中性粒细胞得到动员并迁移进入血管内。但此前公认的骨髓内血流的模型认为：骨髓腔内一条富于营养的主动脉血管穿过骨表面的营养孔结构进入骨干后，形成上升和下降两个主要分支，并迅速分叉形成放射状动脉，进而成为骨皮质毛细血管。这些毛细血管进一步进入髓质血管窦。血管窦的主要责任是收集并放行即将离开骨髓的血液。因此，原有的骨髓内血流学说认为，位于中央髓质腔内营养动脉和血管窦在骨髓内形成了「一进口一出口」的单向通路。但这一学说对于系统给予动员剂后几分钟，中性粒细胞即出现在外周循环的现象始终无法做出合理解释。

得益于骨的透明化技术和光片显微扫描技术，Hasenburg 等人对透明化的长骨进行成像，直观地显示了骨髓内的超微结构后，骨髓内血流结构理论才得到重新认知。研究文献发表在 Nature Metabolism 上。该研究的主要发现在于：

• 骨髓中存在 16 条营养主动脉和 1 条有 2 个出口的中央静脉窦。与此同时，在沿着整个骨干、垂直于骨皮质方向存在数以百计的毛细管结构，在骨髓与骨膜之间形成了直接的循环连接，作者将其命名为穿皮质血管（Trans-Cortical Vessels, TCV）；
• 根据特异标记物染色，这些 TCV 有 60% 为动脉血管（Sca-1 和α -SMA 阳性），40% 为静脉血管（Ephrin B4 阳性）；且根据曲直度、位置和走向，TCV 可被分成 4 类；TCV 的数量、功能和形态受破骨细胞调控，并在如关节炎或骨质疏松等骨质病理条件下出现异常；
• 对胫骨骨髓内血流进行量化分析后发现，TCV 承担了骨髓内绝大部分的血流量，其中包含占总量 83% 的动脉血和 59% 的静脉血。

基于这些数据，得出新的骨髓内血管模型：中央髓质腔内营养动脉和血管窦在骨髓内形成了「16 进口 2 出口」的复杂网络。

• 通过中性粒细胞中特异表达 EGFP 的转基因小鼠发现，TCV 除了承担运送红细胞的责任，中性粒细胞在接收到动员剂（如 G-CSF）刺激后迅速应答并入血，也是经 TCV 实现的，而这种迁移在逆血流方向仍可发生。

 

• 本研究采用了基于乙醇梯度脱水、Ethyl Cinnemate (ECi) 进行透明的 simpleCLEAR 透明化技术，成功将骨组织用于了 3D 成像。通过该种方法，在小鼠胫骨、腓骨、指骨、颅骨中，TCV 结构均可清晰呈现。
• 从生物安全性角度，ECi 多年前即被 FDA 认可为无生物危害效应的有机试剂；从透明化效果的角度看，ECi 对组织的透明化效果好且时间较短

• 通常对于组织内血管的标记是个难题，本研究采用了针对内皮细胞特异性 marker 的 CD31 进行免疫标记。在动物处死前尾静脉注入荧光标记的 CD31 抗体，样本制备后会得到非常漂亮的血管标记。

——美天旎中国——