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临床级细胞分选推进帕金森病干细胞临床试验

人阅读 发布时间:2019-09-04 10:48

帕金森病 (Parkinson’s disease, PD) 全球约有 700 万患者,是仅次于阿尔兹海默症的世界第二大老年神经退行性疾病。主要的病理改变是在中脑黑质区域(substantia nigra),有大量的多巴胺能神经元(dopaminenergic neuron)变性死亡,由此而引起纹状体(striatum)多巴胺含量显著减少而致病。目前还没有有效的治疗方法或者药物能根治该疾病,只能借助综合治疗手段来缓解患者症状。现今最常见的方法是多巴胺调节疗法,但有明显且长期的局限性和副作用,只能改进患者生活和工作质量,却不能阻止疾病发展,患者最终将丧失生活能力。

帕金森病症状与照护
Adapted from:https://www.froedtert.com/

近年来,细胞移植吸引了不少科学家的关注。几项研究发现,将胚胎细胞中的多巴胺神经元移植到患者的脑部,可以缓解帕金森病的症状。随着干细胞技术的兴起、科学家们对于神经发育、帕金森病理机制有更清晰的了解,在不同的动物模型中(大鼠、猴子)已验证: 利用干细胞分化得到的多巴胺能神经前体细胞或神经元移植到病变区域,替代死亡的细胞正常分泌多巴胺,恢复脑中多巴胺水平,最后重建原有的功能。这为干细胞移植的替代治疗提供了很好的临床前试验证据。目前已有临床试验或研究正在全球各地进行或即将开展。


2017年,中国科学院动物研究所和郑州大学第一附属医院协同开展 「人胚胎干细胞来源的神经前体细胞治疗帕金森病」 临床研究,是我国首批通过卫计委和食药监总局备案的干细胞临床研究。由人胚胎干细胞分化的多巴胺能神经前体细胞经过免疫配型后,将被精准地移植到帕金森病患者体内,进行长期的有效性评测。2019 年 7 月,北京协和医院启动了「人源神经干细胞治疗帕金森病的安全性和有效性临床研究」的项目。

2011年,美国纽约 Lorenz Studer 团队发展出的 FP (Floor Plate)-based protocols 利用多能干细胞 (pluripotent stem cell, PSC) 体外定向分化高产量并具有功能性的多巴胺前体细胞及神经元,此方法不断地被全球不同研究团队验证可用于进行临床前试验。日本京都大学干细胞科学家 Jun Takahashi 及其团队使用优化的 FP-based protocol,将健康人群和帕金森患者的诱导多能干细胞 (induced pluripotent stem cell, iPS) 转化为多巴胺前体细胞与神经元。他们发现将一特定细胞表面标记蛋白 Corin (Floor plate marker) 阳性细胞从多巴胺前体细胞族群分选富集后,可在体外或动物体内分化成成熟具有功能性的多巴胺神经元。更重要的是,与未分选富集的分化细胞相比,Corin 阳性多巴胺前体细胞在动物体内存活率大大提高、没有肿瘤细胞形成、明显改善 PD 症状

人源 iPS 细胞进行多巴胺神经分化 12 天后,经 Corin 阳性细胞分选并持续体外分化成熟多巴胺神经元。42 天后的 Corin+细胞群明显产生更多的多巴胺神经元 (NURR1/TH+ expression) Adapted from Stem Cell Reports, 2014, v2,337-350


2017年8月,Jun Takahashi 团队也证实将健康人群和帕金森患者的 iPS 细胞转化并分选出的 Corin 阳性多巴胺前体细胞 (DA progenitor) 可改善猴子的帕金森病症状。这些细胞移植到猕猴帕金森模型中存活了至少两年,并与猴子的脑细胞形成了连接,经细胞治疗的猴子运动能力得到显著改善。
 


 
2018 年 10 月,Jun Takahashi 团队开展了利用 iPS 细胞治疗帕金森病的临床试验,向一名 50 多岁的男性患者脑部移植了由他人iPS细胞培养的 240 万个多巴胺前体细胞。到目前为止这名患者表现良好,没有出现重大不良反应。该团队计划在 2020 年底之前再治疗 6 名帕金森病患者,以便测试这干细胞移植技术的安全性和有效性。
 
Production process of dopaminergic progenitors in Jun Takahashi's group


在这干细胞技术生产制备多巴胺前体细胞,分选出Corin 阳性多巴胺前体细胞是一关键步骤。以往 Jun Takahashi 团队在 iPS 细胞分化 12 天使用传统高压液滴分选仪,可获得高纯度(>90%)Corin 阳性多巴胺前体细胞,然而分选后的细胞活力明显变差,最终降低整体细胞产量。为达到足够细胞数(~5百万细胞/patient)供 PD  患者细胞移植以及制备过程中的质量管控分析,需要专人不间断操作 16 小时才能分选富集出足够的 Corin 阳性多巴胺前体细胞。且传统液滴分选仪大多为一开放系统,需在 GMP 级细胞实验室的超净工作台内操作,对操作人员的专业技术要求也非常之高,以防操作时细胞不慎污染,不仅浪费前期细胞制备,更重要的是被污染细胞若移植到患者体内会产生不良反应,导致患者死亡。

 
美天旎MACSQuant® Tyto® 
革命性的细胞分选仪

专利的微芯片技术,精准地控制阀门开合以进行细胞分选,该仪器的特性在于整个分选过程在一次性使用的全封闭样本舱(cartridge) 中进行,且无需液流、避免了样本污染和残留风险。

上样简单、自动进行分选设置,无需操作人员进行高强度与长时间的培训就能轻松操作。由于实际分选过程都在样本舱进行,不会损失珍贵的样本材料;阳性和阴性分选组份均可在无菌洁净操作台内轻松回收。

细胞不会受到高压、电荷及减压刺激,不同于传统的液滴分选仪,这种温和的分选方法可最大保持细胞活性和功能,即使经过多次分选,细胞活性也不会受影响,充分表明这种阀门介导的分选机制具有温和性质。

美天旎 MACSQuant® Tyto® 细胞分选仪与样本舱功能示意图

Jun Takahashi 团队对于 MACSQuant® Tyto®(MQ Tyto)和传统液滴细胞分选仪进行了 Corin 阳性多巴胺前体细胞分选与后续细胞存活及神经分化作了一系列对比。

1. MQ Tyto 细胞分选可获得纯度超过 90% Corin 阳性多巴胺前体细胞 
(>90% purity of sorted Corin positive cells)

经由 MQ Tyto 一次分选或二次分选 Corin阳性多巴胺前体细胞和传统液滴细胞分选仪比较,均能获得 90% 以上的细胞纯度与 ~50% 的细胞产率。

 


2. 分选后的 Corin 阳性多巴胺前体细胞存活率高并具有增殖活力
(Post-sort survival and final yield increased by using MQ Tyto)


分选后的 Corin 阳性多巴胺前体细胞随后使之聚集形成球体 (neurospheres) 以确保均匀分化,直到第 30 天,具有所需中脑表型的多巴胺能神经元被移植到 PD患者的纹状体中。细胞存活率与细胞产量便以球体大小进行对比。经由 MQ Tyto 分选后所形成的 neurosphere 球体明显增大 1.3 倍,显示细胞存活率高并具有增殖活力。



3. MQ Tyto 分选后的Corin阳性多巴胺前体细胞在体外分化可促进神经突生长
(Increased neurite extension of MQ Tyto sorted cells indicated graft survival capacity and reinnervation)


MQ Tyto 分选后的Corin阳性多巴胺前体细胞在体外进一步分化成神经元,其神经纤维/神经突显著增长,由此用以检视移植后在人体内的移植细胞具有神经功能并延伸其神经突与宿主的脑细胞形成连接。
 

4. MQ Tyto 大大减少操作时间
(Reduced operator time)


为获得 3x107 Corin阳性多巴胺前体细胞, 相比以往传统液滴分选需不间断操作16小时,人员操作 MQ Tyto 仅需一小时。



综上,利用 MQ Tyto 对干细胞分化的多巴胺前体细胞进行表面标记蛋白Corin 分选,corin+ 纯度达 90%,细胞存活率高,且仍保有多巴胺神经分化功能。操作方便,且需人员操作的时间短。更重要的是,整个细胞分选过程是在一个密闭无菌的环境下完成;完全符合细胞移植临床试验的要求。以上实验研究结果,Jun Takahashi 团队已在 2019 年国际干细胞年会上发表。MQ Tyto 也已开始应用于日本帕金森病干细胞移植临床试验。


获取详细资料,请发送邮件到 macs@miltenyibiotec.com.cn


文献参考:

1.GMP-compliant Microchip Based Cell Sorting of iPSC-derived Dopaminergic Progenitors. Daisuke Doi, Jens Gaiser, Daril Grummitt, Sebastian Knoebel and Jun Takashashi. Poster and Presentation at ISSCR2019
2.Human Clinical-Grade Parthenogenetic ESC-Derived Dopaminergic Neurons Recover Locomotive Defects of Nonhuman Primate Models of Parkinson's Disease. Stem Cell Reports. 2018 Jul 10;11(1):171-182
3.Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 2017 Aug 30;548(7669):592-596.
4.Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports. 2014 Mar 6;2(3):337-50.
5. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 2011 Nov 6;480(7378):547-51



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