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从神经干细胞分化命运到退行性疾病，神经再生与修复可能不再遥远
人阅读 发布时间：2020-05-27 16:53
神经退行性疾病是由神经元结构和功能的逐步丧失引起的疾病，包括脑内神经元退行引起的阿尔茨海默症、帕金森症；视网膜神经元退行引起的视网膜色素变性、脊髓神经元退行导致的多发性硬化等。中枢神经系统由于其复杂性，特别是神经元作为终末分化细胞的不可再生特性，因此探寻中枢神经元的修复与再生，一直是神经科学研究的前沿方向。
近期，多篇研究文献报道了对视网膜神经的修复，方法不尽相同，但最终都达到了令彻底失明的模型动物重新恢复视觉的目的。
● 2020 年 4 月 8 日，UCSD 张康团队与付向东合作发表了文章 Visual function restoration in genetically blind mice via endogenous cellular reprogramming，开发了一种原位细胞重编程策略。通过 shRNA 抑制 RNA 结合蛋白 PTB 并外源强制表达 Ascl1，成功地将 Müller 胶质细胞重编程后并发育为多种神经元，包括视受体、中间神经元和视网膜神经节细胞等，有效地恢复了晚/末期色素性视网膜炎患者的视力。
● 2020 年 4 月 15 日，北德克萨斯大学药理与神经科学系 Sai H. Chavala 团队在 Nature 杂志上发表题为 Pharmacologic fibroblast reprogramming into photoreceptors restores vision 的研究论文。在这篇文章中，研究者通过使用小分子 cocktail 将小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）诱导生成光受体样细胞（Photoreceptor-like cells, CiPCs）；而后将 CiPCs 移植到视网膜视杆细胞退行性 rd1 小鼠（又称做 Pde6b 小鼠）视网膜下腔，能够部分恢复瞳孔反射和视觉功能，令动物重获瞳孔反射效应和视觉功能。
细胞重编程和神经干细胞调控的进一步探索与理解将带动新型细胞的产生，为再生医学提供理论基础。
神经干细胞
神经干细胞 (Neural stem cells，NSCs) 具有不断自我更新和分化成多种神经细胞类型的能力。在成熟发育的脑组织中，主要存在于脑室下腔 (subventricular zone，SVZ) 和海马齿状回（dentate gyrus）。现已知，成体神经干细胞在发生脑损伤及神经元的退行时，会出现代偿性增殖。尽管如此，NSC 始终是数量极为稀少且敏感的细胞群体，实验操作中通常依赖多种细胞标记物组合加以鉴定和分离。
神经干细胞分化命运及识别
神经干细胞识别的最大困难在于将位于 SVZ 区的活化的星形胶质细胞前体与周质内的星形胶质细胞区分开来。充分了解 NSC 向神经元分化中依时程先后表达的多种标记物组合，为分离和鉴定提供依据。下图示意了 SVZ 区干细胞的时程分化标记物表达。
GFAP（+）SVZ 星形胶质干细胞分化形成快速分裂的 EGFR+细胞，这群细胞发展为 CD24+的神经母细胞并迁移至嗅球，最终分化为成熟神经元。
Plexin-B2，semaphorin 脑信号受体，在胚胎时期脑神经元增殖和向小脑迁移中发挥作用；在出生后和成熟脑中，Plexin-B2 阳性的细胞主要表达在 SVZ 端脑脑室、向喙端迁移的沿线，在出生后动物的神经发生中具有重要作用。【1】因此，是神经干细胞的重要标记物。
因此，我们推荐 GLAST (+) Plexin-B2（+）CD24 (-) 表型的细胞作为 SVZ 神经干细胞的标记物。与此同时，在细胞圈门 Gating strategy 上，也应该注意使用红细胞标记物（如 Ter119）做排除。
神经干细胞分选
神经干细胞是一类数量极少、对操作条件极敏感的细胞。传统流式细胞分选仪器是基于高压力将细胞分散后，对细胞外加电荷后加进行识别和获取的。不仅如此，被选中的细胞从喷嘴喷出的时刻，会因突然的减压遭受应激。因此，分选后的细胞活力一直给下游应用比如体外培养、单细胞测序分析、移植等带来巨大困扰。
基于微芯片的 MACSQuant Tyto 细胞分选仪，不对细胞加电荷和压力，完成温和分选。采用独立的样本舱设计，无气溶胶产生，保护样品间无夹带的同时，保护操作人员不受样本中病原体侵害。
从成年小鼠脑获得 SVZ 神经干细胞完整流程
整个工作流程从分离 5 只 7-9 周成年 C57BL6 小鼠脑 SVZ 区开始，使用 Neural Dissociation Kit 搭配 gentleMACS 组织解离器解离为高活力的脑组织单细胞悬液后，采用 Adult Neural Stem Cell Sorting and Analysis Kit 标记后上样至 MACSQuant Tyto 细胞分选仪进行目的细胞分选。
神经球生成测试用以检测分选后 NSC 的增殖和分化潜能。分选得到的 NSC 在培养条件下可传代形成子代神经球 (A–B)。通过特异性标记物可见，神经球在分化培养基中可分别分化形成胶质细胞及神经元，GFAP, nestin, GLAST, MAP2, and O4 (C–F).
更有符合 GMP 标准的样本舱，在全球首例诱导多能干细胞分化多巴胺能神经元进行帕金森症的临床应用中，因所得目的细胞从数量和活力两方面效果均优于多种主流流式分选仪，而被采纳。现在，全球范围内开展的肿瘤免疫临床试验并采用 MACSQuant Tyto 进行目的细胞分选的项目更是众多。
【1】B. Saha et al. J Neurosci. 2012 Nov 21;32(47):16892-905
近期，多篇研究文献报道了对视网膜神经的修复，方法不尽相同，但最终都达到了令彻底失明的模型动物重新恢复视觉的目的。
● 2020 年 4 月 8 日，UCSD 张康团队与付向东合作发表了文章 Visual function restoration in genetically blind mice via endogenous cellular reprogramming，开发了一种原位细胞重编程策略。通过 shRNA 抑制 RNA 结合蛋白 PTB 并外源强制表达 Ascl1，成功地将 Müller 胶质细胞重编程后并发育为多种神经元，包括视受体、中间神经元和视网膜神经节细胞等，有效地恢复了晚/末期色素性视网膜炎患者的视力。
● 2020 年 4 月 15 日，北德克萨斯大学药理与神经科学系 Sai H. Chavala 团队在 Nature 杂志上发表题为 Pharmacologic fibroblast reprogramming into photoreceptors restores vision 的研究论文。在这篇文章中，研究者通过使用小分子 cocktail 将小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）诱导生成光受体样细胞（Photoreceptor-like cells, CiPCs）；而后将 CiPCs 移植到视网膜视杆细胞退行性 rd1 小鼠（又称做 Pde6b 小鼠）视网膜下腔，能够部分恢复瞳孔反射和视觉功能，令动物重获瞳孔反射效应和视觉功能。
细胞重编程和神经干细胞调控的进一步探索与理解将带动新型细胞的产生，为再生医学提供理论基础。
神经干细胞
神经干细胞 (Neural stem cells，NSCs) 具有不断自我更新和分化成多种神经细胞类型的能力。在成熟发育的脑组织中，主要存在于脑室下腔 (subventricular zone，SVZ) 和海马齿状回（dentate gyrus）。现已知，成体神经干细胞在发生脑损伤及神经元的退行时，会出现代偿性增殖。尽管如此，NSC 始终是数量极为稀少且敏感的细胞群体，实验操作中通常依赖多种细胞标记物组合加以鉴定和分离。
神经干细胞分化命运及识别
神经干细胞识别的最大困难在于将位于 SVZ 区的活化的星形胶质细胞前体与周质内的星形胶质细胞区分开来。充分了解 NSC 向神经元分化中依时程先后表达的多种标记物组合，为分离和鉴定提供依据。下图示意了 SVZ 区干细胞的时程分化标记物表达。
GFAP（+）SVZ 星形胶质干细胞分化形成快速分裂的 EGFR+细胞，这群细胞发展为 CD24+的神经母细胞并迁移至嗅球，最终分化为成熟神经元。
Plexin-B2，semaphorin 脑信号受体，在胚胎时期脑神经元增殖和向小脑迁移中发挥作用；在出生后和成熟脑中，Plexin-B2 阳性的细胞主要表达在 SVZ 端脑脑室、向喙端迁移的沿线，在出生后动物的神经发生中具有重要作用。【1】因此，是神经干细胞的重要标记物。
因此，我们推荐 GLAST (+) Plexin-B2（+）CD24 (-) 表型的细胞作为 SVZ 神经干细胞的标记物。与此同时，在细胞圈门 Gating strategy 上，也应该注意使用红细胞标记物（如 Ter119）做排除。
神经干细胞分选
神经干细胞是一类数量极少、对操作条件极敏感的细胞。传统流式细胞分选仪器是基于高压力将细胞分散后，对细胞外加电荷后加进行识别和获取的。不仅如此，被选中的细胞从喷嘴喷出的时刻，会因突然的减压遭受应激。因此，分选后的细胞活力一直给下游应用比如体外培养、单细胞测序分析、移植等带来巨大困扰。
基于微芯片的 MACSQuant Tyto 细胞分选仪，不对细胞加电荷和压力，完成温和分选。采用独立的样本舱设计，无气溶胶产生，保护样品间无夹带的同时，保护操作人员不受样本中病原体侵害。
从成年小鼠脑获得 SVZ 神经干细胞完整流程
整个工作流程从分离 5 只 7-9 周成年 C57BL6 小鼠脑 SVZ 区开始，使用 Neural Dissociation Kit 搭配 gentleMACS 组织解离器解离为高活力的脑组织单细胞悬液后，采用 Adult Neural Stem Cell Sorting and Analysis Kit 标记后上样至 MACSQuant Tyto 细胞分选仪进行目的细胞分选。
神经球生成测试用以检测分选后 NSC 的增殖和分化潜能。分选得到的 NSC 在培养条件下可传代形成子代神经球 (A–B)。通过特异性标记物可见，神经球在分化培养基中可分别分化形成胶质细胞及神经元，GFAP, nestin, GLAST, MAP2, and O4 (C–F).
更有符合 GMP 标准的样本舱，在全球首例诱导多能干细胞分化多巴胺能神经元进行帕金森症的临床应用中，因所得目的细胞从数量和活力两方面效果均优于多种主流流式分选仪，而被采纳。现在，全球范围内开展的肿瘤免疫临床试验并采用 MACSQuant Tyto 进行目的细胞分选的项目更是众多。
【1】B. Saha et al. J Neurosci. 2012 Nov 21;32(47):16892-905
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