组织透明化及使用光片显微镜对透明组织进行整体 3D 成像令研究器官整体功能、疾病对器官结构功能已成为了现实，近年来越来越受到从事神经生物学、再生医学、肿瘤免疫及胚胎发育研究学者的青睐，屡见于顶尖学术期刊。


近日北京大学杨竞课题组首次通过完整未经常规切片的方式，观察到一种只存在于脾脏实质的特殊花序状交感神经结构，在抗细菌感染的自身免疫反应中发挥负向调控的作用，这项研究直观体现了神经系统对免疫的调节功能。

借助 3D 成像带来的全新视野，伴随新发现被揭示的同时，新技术也不断诞生。该研究的技术亮点在于，突破了脾脏血管丰富，大量红细胞造成的强吸收给整体 3D 成像带来的困扰，开发了一种被称作 ImmuView 的技术，令脾脏透明化并进行全组织三维荧光成像成为可能。该研究以为数不算多但绝对够亮眼的图像数据直观呈现创新点，发表在 6 月 25 日 Cell Report 杂志。

再来看一篇最新发表于 Nature Communication 从事心脏缺血的研究。 作者采用了心脏 3D 成像和量化分析方法，巧妙地利用了心肌具备自发荧光地特性，第一次详细直观呈现了心脏缺血及再灌注（I/R）后的损伤灶分布，并基于 3D 成像数据构建了心肌坏死风险预测模型，这对心肌梗塞病人救治方案提供了参考。本文还通过高分辨率的 3D 成像，观察到心脏修复过程中出现局部高度空间化的中性粒细胞浸润过程。    

• 最早的组织透明化方法诞生于 100 年前，由一位名叫 Spalteholz 的德国化学家发明；
• 组织透明化的原理是使用特定溶剂，将组织内可将可见光散射的成分去除，并使整个组织的光折射率一致化，这样光可以无阻挡且无散射地穿透整个组织块；
• 常用于组织透明化的试剂有乙醇， 四氢呋|喃，benzyl alcohol–benzyl benzoate（BABB 或 Murray 透明法）和 dibenzyl ether (DBE)；

成功的组织透明化是高质量 3D 成像的关键因素，已经有多种透明化方法被开发并公开发表，选择适合目的应用的透明化方法至关重要。当然，每种方法也各有优劣：

3DISCO (3-Dimensional Imaging of Solvent-Cleared Organs)

Pros

• 为大组织样本提供了精确且快速获取完整组织学信息的方法，包括其中被标记细胞/分子的空间位置及分布信息，已验证用于肺、脾、乳腺、淋巴结、肿瘤组织、神经系统等，是一种具普适性的研究方法；
• 与其他组织透明方法相比工作流程更短：对于小组织（如脊髓、乳腺、淋巴结等）的透明化处理只需要 4-6 个小时即可完成，即使是完整脑组织等大组织块，也只需要 1 天即可；
• 特别适合于内源性表达有荧光蛋白的组织块成像，兼容多种荧光信号 (CFP, GFP, RFP, mCherry 等)；

Cons

• 该方法处理过的组织无法长时间保存；
• 无法再用于其他电子显微镜成像观察，也无法用于亲脂性染料染色（如常见的示踪染料）；
• 需要使用荧光信号较强的荧光染料标记，黄色荧光蛋白（YFP）在 3DISCO 处理后极不稳定；

iDISCO (immunolabeling-enabled three-Dimensional Imaging of Solvent-Cleared Organs)

Pros

• 该方法非常适合基于免疫标记的大样本 3D 成像，可令组织内部充分进行免疫标记，包括 18.5 天的鼠胚胎、成体脑、肾等器官；
• iDISCO 通常基于 Alexa Fluor 染料, 配合光片显微镜成像的方法，光漂白效应非常低；同时免疫标记也被固定在组织内，可在室温条件稳定保存数月；
• 通常来讲，如果一支抗体在免疫荧光实验中能提供较强的信号和较低背景的话，那么它在 iDISCO 3D 成像应用中的性能很可能不会差。前期实验能给出对于组织块免疫标记的前瞻预测，这是很重要的，毕竟 iDISCO 对于时间和试剂的消耗不容忽视。

Cons

• 操作时间较长，对于成年鼠脑的 iDISCO 透明化和免疫染色通常需要 4-5 天才能完成，且抗体消耗量较大；
• iDISCO 不能用于同时表达荧光信号谱的 Brainbow 和 Confetti 转基因小鼠，因为目前还没有抗体可识别如此之多的荧光蛋白。

对于 iDISCO 的方法更新及最新应用，https://idisco.info/提供了全球从事组织透明化研究的信息共享平台。
实现完美的透明化组织样品实属不易，还要借助专用于大样本成像工具实现图像采集。光片显微镜（light sheet microscope）因发射激光束可在样本上实现对一个平面进行整体成像而得名，入射光与聚焦平面一致而信号采集与成像平面垂直，最大程度扩大了成像范围的同时，因为激发光只照射样品的一个平面而非穿透样本整体，因此极大降低了光毒性。光片显微镜和共聚焦显微镜的成像原理区别见下图所示：
一台高性能的光片显微镜，才必不辜负前期繁复的样品制备工序。特别是支持扫描快速、兼容无毒透明化试剂且完好稳定荧光信号的光片显微镜，更是 3D 成像研究领域的高手。

 
LaVision 自 1989 年成立来致力面向工业与科研的激光成像测量系统及其软件的开发，是由德国马普研究所和德国哥廷根大学激光实验室共同创立的。LaVision 一直与全球顶级科学家、研究团体和技术公司紧密合作并于 2018 年加入 Miltenyi Biotec。
2014 年 UltraMicroscopeⅡ 问世以来，已经为哈佛大学、耶鲁大学、德国马普所等顶尖研究机构所认可，被认为是整体 3D 成像领域最高质量供应商。近年来使用 LaVision 发表于 Nature 等顶级学术刊物的文章数量呈快速增长趋势。

LaVision 光片显微镜的特点：

• 大视野——保证单次扫描面积更大，才能实现大样本的整体图像采集；
• 灵活度高——无论是宏观整体还是单细胞水平，均能获得超高的分辨率；
• 兼容性好——兼容几乎所有有机和无机透明化试剂；
• 采集速度快——获取完整鼠脑的图像数据，只需 10 分钟；
• 数据文件小——更少避免数据破损，数据处理和转移更加便捷；

LaVision 作为当前先进的光片成像仪器，其应用涉及神经生物学、免疫学、胚胎发育学、肿瘤学、干细胞再生医学等领先学科，成功采集器官整体图像的器官涵盖脑、心脏、肺、肾、肝、胰腺等重要器官。



了解更多信息，您可以直接联系美天旎
免费热线：800 820 2606
微信公众号：Miltenyi_MACS
邮箱：meih@miltenyibiotec.com.cn
网址：www.miltenyibiotec.com