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公司新闻/正文
应用gentleMACS™灌流技术从脂肪肝小鼠模型高效分离肝细胞与非实质细胞
332 人阅读发布时间：2025-11-28 17:12
肝细胞是肝脏的主要功能细胞，在代谢、解毒和蛋白合成中发挥着至关重要的作用。传统的灌流技术虽然可以有效分离肝细胞，但仍存在一些挑战：这些方法往往耗时费力，依赖于丰富的操作经验，不同操作者之间细胞的得率和活性差异较大。尤其是在处理病变肝组织时，脂肪堆积、纤维化以及血管结构改变都使得灌流与肝细胞分离更为困难。美天旎gentleMACS™ 灌流技术提供了一种简便的自动化离体肝脏灌流方案，用于啮齿动物的肝细胞分离，创新地减少了手工操作、缩短了处理时间、允许平行处理多个样本，新手也能快速上手获得高度可重复的结果。
来自日本久留米大学（Kurume University）的研究者在gentleMACS小鼠肝脏灌流标准protocol的基础上做了改良，使其适用于研究代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎（MASH）的肝硬化小鼠模型，成功实现肝硬化小鼠的高效肝脏灌流，同时获得高活性肝细胞和非实质细胞（NPC），助力探索肝脏代谢相关疾病的病理机制及潜在治疗方法。
方法与结果
1，小鼠准备
使用 STAM（Stelic Animal Model）小鼠模型，该模型可模拟人类MASH或肝细胞癌（HCC）的疾病进展。造模方法如下（图 1）：
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出生 2 天的雄性C57BL/6 小鼠接受链脲佐菌素（streptozotocin，200µg/只） 注射，以削弱胰岛素分泌能力。
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4 周龄时给予高脂饲料（High Fat Diet32），模拟晚期 2 型糖尿病表型，进而诱导脂肪肝、MASH、纤维化，最终发展为 HCC。
16 周龄时处死 STAM 小鼠，切取左侧肝叶，使用 gentleMACS Octo八通道带加热全自动组织解离器结合肝脏灌流试剂盒与灌流管进行离体灌注，保留肝脏的其余部分用于免疫组化染色。
图1：正常肝脏向HCC的进展过程1。MASLD，代谢功能障碍相关脂肪性肝病。
2，离体肝脏灌流
切下的小鼠左侧肝叶使用 gentleMACS 灌流技术（包含gentleMACS Perfuser、Liver Perfusion Kit 和 Perfusion Sleeves）进行处理。相比试剂盒说明书中的常规小鼠肝脏灌流protocol，对 STAM 小鼠的操作做如下两处优化：
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采用常规大鼠肝脏灌注程序37C_r_LIPK_1替代小鼠程序37C_m_LIPK_1，相较于标准小鼠程序延长了酶解时间（小鼠10分钟，大鼠程序12.5 分钟）。
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组织解离和肝细胞释放后，4°C，30×g离心5分钟，去上清，重复一次。
离心后肝细胞在沉淀部分，收集上清液用于分离NPC，如肝窦内皮细胞（LSEC）。
3，细胞分离与检测
3.1 肝细胞
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轻柔重悬肝细胞沉淀，使用血球计数板与台盼蓝染色测定细胞数量与活性，结果如表 1。
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肝细胞接种于 I 型胶原包被的6孔板中，培养基为10% FBS/DMEM+青链霉素。12小时后洗去未贴壁死细胞。
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培养24小时后，明场显微镜及免疫荧光染色确认肝细胞形态及特异性标志物（白蛋白和 E-cadherin），结果如图 2。
表 1：肝细胞的得率和活率。得率以每个左外肝叶得到的肝细胞总数及每克肝脏得到的肝细胞数表示，活率基于台盼蓝染色，肝叶取自16周龄雄性STAM小鼠。
图2：肝细胞培养24小时后，（A）明场显微镜观察可见其特征性的六边形双核形态。免疫荧光染色进一步证实，gentleMACS灌流技术分离的肝细胞表达典型的实质细胞标志物，包括（B）白蛋白和（C）E-cadherin，蓝色为细胞核DAPI染色。
3.2 LSEC
为分离LSEC，对其中一份样本的上清液做进一步处理。
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使用MACSQuant Analyzer 16流式细胞仪分析，根据散射信号和PI染色排除细胞碎片和死细胞。结果显示这个肝叶总共得到4.7×10⁶个NPC（对应每克肝组织1.38×10⁷个细胞），活率达97%（图3A）。
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在此基础上，使用特异性标记物鉴定LSEC并排除其他细胞类型（图3B）。CD31-PE-Vio® 770（REA784）染色阳性的为LSEC（即内皮细胞），CD45-VioBlue®（REA737）阳性的为非LSEC细胞，如白细胞。流式分析结果显示LSEC得率约为1.3×10⁶个。
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随后使用CD45+和CD146+磁珠富集LSEC，autoMACS® NEO全自动分选仪阳性选择CD146+细胞（LSEC），同时去除CD45+白细胞。PI染色后流式分析，结果显示磁分选富集处理将LSEC纯度从29%提升至92%（图3C）。
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富集的 LSEC 按1×10⁶/孔接种于包被I型胶原的6孔板，用含5% FBS的EGM™-2 MV微血管内皮细胞培养基套装培养。为验证离体灌流后分离的LSEC的特性与功能，44小时后对细胞做2小时血清饥饿处理，加10mg/ml Dil-ac-LDL（Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白）孵育4小时，洗涤后荧光显微镜观察。如图 4，LSEC成功摄取Dil-ac-LDL，符合其典型表型，证实LSEC在暴露于富含脂肪酸的环境后能够保留其典型特征。
图3：鉴定LSEC的圈门策略。（A）根据散射信号和PI染色排除死细胞后，NPC数量达4.7×10⁶个。（B）根据CD45和CD31表达鉴定LSEC，即CD45- CD31+细胞群。（C）磁分选富集后，CD31+ CD45-细胞纯度从29%提升至92%。
图4：培养44小时后的LSEC，红色荧光表明Dil-ac-LDL被摄取，证实了培养LSEC的功能活性。
4，组织学染色
对其余肝组织进行组织学染色，以确认MASH病理改变。HE染色显示脂滴（脂肪变性）聚集在肝细胞胞浆中（图5A）。天狼星红染色显示从中央静脉周围向邻近肝细胞扩散的轻度纤维化，与人类MASH组织学特征相似（图5B）。这些结果确认STAM小鼠存在脂肪肝病理，可以用作研究脂肪肝的模型。
图5：（A）HE染色观察组织整体形态及细胞细节，证实存在脂肪肝（肝细胞内脂肪滴积聚）及炎症改变。（B）天狼星红染色显示肝脏样本中的胶原纤维。
结论
美天旎生物技术基于gentleMACS灌流技术开发了一种可靠的自动化方法，从解剖的肝脏样本中分离高质量的实质细胞和NPC。多篇文献已证实该技术可成功从健康啮齿动物肝脏中分离肝细胞2-6。本研究采用STAM小鼠作为MASH肝病模型，证实gentleMACS灌流技术能高效地从脂肪肝样本中分离完整且功能正常的肝细胞及LSEC（作为NPC的代表性亚群），同时实现高得率与高活率。此外，gentleMACS灌流技术仅需单个肝叶进行离体灌流，能够保留同一动物的其余组织用于免疫组化、生化和分子分析等其他实验，显著提高实验效率，并确保实验数据可靠一致。
参考文献
1. Hansen, H. et al. (2017) Mouse models of nonalcoholic steatohepatitis in preclinical drug development. Drug Discovery Today 22: 1707–1718.
2. Poggel, C. et al. (2022) Isolation of hepatocytes from liver tissue by a novel, semi-automated perfusion technology. Biomedicines 10: 2198.
3. Nikopoulou, C. et al. (2023) Spatial and single-cell profiling of the metabolome, transcriptome and epigenome of the aging mouse liver. Nature Aging 3: 1430–1445.
4. Conceicao-Neto, N. et al. (2023) Sustained liver HBsAg loss and clonal T- and B-cell expansion upon therapeutic DNA vaccination require low HBsAg levels. Vaccines 11: 1825.
5. Van Gulck, E. et al. (2024) Retreatment with HBV siRNA Results in Additional Reduction in HBV Antigenemia and Immune Stimulation in the AAV-HBV Mouse Model. Viruses 16: 347.
6. De Pooter, D. et al. (2024) Robust isolation protocol for mouse leukocytes from blood and liver resident cells for immunology research. PLoS One 19: e0304063.