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文献分享 | 不同的细胞分选方式对细胞多组学研究结果的影响
723 人阅读发布时间：2024-05-14 11:56
在生物系统中，细胞是由具有不同表型和功能的亚群组成的异质混合物。这种复杂性制约着细胞功能的方方面面，并积极调节着细胞的新陈代谢和命运。单细胞培养虽然具有高通量且方便的特点，但由于其新陈代谢和功能与体内系统不同，因此对生物学的了解有限。然而，分析组织或生物流体中的特定细胞类型还面临着从异质来源中分离的挑战。现阶段广泛的生物医学研究和临床应用中，流式细胞分选已成为分选特定细胞群的宝贵工具，科学家们利用单细胞分析来更好的了解不同细胞群的意义和变化。然而，大多数现有的细胞分选仪是基于液滴式分选，这种分选原理对细胞进行分选过程中不可避免产生如高压、剪切应力、高压电场或激光照射，所有这些都可能对分选细胞完整性产生负面影响，并损害从下游应用中获得的数据。流式细胞界越来越意识到分选细胞可能产生的负面影响，可能从轻微的功能缺陷到彻底的细胞破坏。分选诱导细胞应激——“sorter induced cell stress” (SICS)一词越来越受到重视[1]。然而，迄今为止，只有少数研究调查了细胞分选对细胞活力和功能的影响[2]。2021年Kamilah Ryan等人发表题为“Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS)”的文章，通过代谢层面研究SICS，研究结果表明，SICS代谢表型是一种与细胞类型无关的常见表现，预示着一系列与代谢或细胞应激反应通路直接相关的功能缺陷。同时，证明了改变液滴式细胞分选中的流体环境可以在很大程度上挽救SICS的细胞内标记 [3]。
阿斯利康(AstraZeneca)作为全球先的制药公司，2024年2月阿斯利康生物制药研发中心Choudhury等人发表的论文将Becton Dickinson FACS Aria III Fusion（Aria）的液滴式分选与 Miltenyi MACSQuant Tyto（Tyto）的微芯片流式分选进行了比较，以研究蛋白质组学和代谢组学水平上的细胞变化。文章指出，与基于液滴式分选相比，基于微芯片的分选对新陈代谢的影响最小，破坏性也更小。
图1：实验工作流程示意图
分选仪诱导的代谢变化
研究者收集了不同类型的细胞（即原代T细胞、B细胞、单核细胞和Tregs以及淋巴母细胞系K562），并在Tyto和Aria上进行了分选，同时保留了一部分未分选的细胞作为对照。之后，一部分细胞被冷冻，另一部分重新悬浮在培养基中进行细胞培养 6、24 和 48 小时，以观察细胞是否能在分选后恢复。从冷冻细胞中制备上清液和蛋白颗粒，用于分析代谢组学、脂质组学、蛋白质组学和磷酸蛋白组学。在不同的代谢组学分析中，用13C标记培养细胞以进行同位素追踪。与基于微芯片Tyto分选相比，基于液滴式分选Aria能引起更大的代谢谱变化。
图2：(a)文氏图显示了淋巴母细胞a (K562)、(b) CAR-T、(c)Tregs和(d)B细胞中代谢和脂质组合图谱的变化。与对照组相比，只有代谢物和脂质发生了明显变化（Benjamini-Hochberg FDR p值小于0.05）且折叠变化大于2，才会显示出来。(e)基于Kendall排序相关性分析的不同组间代谢和脂质组合特征系数，包括 K562（56个代谢物）、CAR-T（587个代谢物）、Tregs（587个代谢物）和B细胞（33个代谢物）。(f）热图显示与对照细胞相比，显著影响的代谢物（单因素方差分析，调整后p值<0.05，MS置信度为1级）及其代谢途径。
线粒体能量代谢
使用液滴式细胞分选仪分选的细胞在氧化还原和能量状态方面发生了更大的变化，蛋白质稳态也发生了更大的变化。对分选后恢复的细胞进行的13C 同位素追踪分析表明，分选引起的线粒体 TCA 循环活性抑制在基于微芯片的分选组中恢复得更快。
图3：13C同位素标记实验流程和结果
氧化还原代谢
分选后，在培养物中生长6、24和48小时的淋巴母细胞K562细胞中测量氧化与还原谷胱甘肽（GSSG/GSH）的比率。较高的GSSG/GSH比率作为细胞氧化应激的有力指标。在6 h时，基于液滴式分选细胞具有较高的GSSG/ GSH比率，并在24小时内返回到对照细胞水平，而在基于微芯片的分选组中，该比率在任何时候都没有显着变化，表明这种分选技术对细胞氧化还原平衡的影响最小（图4a）。该结果与成像分析相辅相成，以测量活性氧（ROS）的积累。使用ROS敏感染料，能够确认在通过基于液滴而不是基于微芯片的技术分选的细胞中分选后立即存在ROS积累（图4b）。还分析了谷氨酰胺产生谷胱甘肽的过程，谷胱甘肽作为细胞中的主要抗氧化剂。在分选细胞中，6 h时谷胱甘肽（GSH）的产生受到抑制，在基于液滴式分选组中观察到的抑制作用最高；值得注意的是，通过Tyto微芯片技术分选的细胞在24小时内恢复。尽管如此，在基于液滴式分选细胞中，氧化谷胱甘肽的产生分别在24小时和48小时仍然较高。在K562细胞中，还看到基于液滴式分选细胞中的ADP与ATP比率显着增加，该比率在24小时内恢复到对照组细胞的水平，而基于微芯片分选细胞中的比率在所有时间点都没有改变（图4c）。
图4：氧化还原代谢实验结果
氨基酸和脂质生物合成
使用13C同位素追踪方案，发现分选细胞中葡萄糖中丙氨酸、天冬氨酸和丝氨酸的生物合成受到抑制，在基于液滴式分选组中抑制作用最高（图5a，b）。在基于微芯片的分选组中，它们在48小时内接近对照组细胞的水平，但基于液滴式分选组始终落后（图5a，b）。基于液滴式分选细胞还抑制了葡萄糖中用于磷脂生物合成的甘油-3-磷酸的产生，这表明脂质代谢可能受到这种分选技术的影响（图5c）。在类似的实验中，[U–13C]谷氨酰胺、脯氨酸和棕榈酸酯的生物合成显示出与其他途径相同的趋势，其中基于液滴式分选细胞不仅受影响最大，而且除谷氨酸外，其他均未能在48小时内完全恢复（图 5d-f）。在基于液滴式分选组中，谷氨酰胺产生的天冬氨酰胺在6小时内也被抑制。
图5：氨基酸和脂质生物合成实验结果
分选诱导的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学变化
除了代谢和脂质组学改变外，针对同样的细胞亚群的流式分选诱导的蛋白质组和磷酸化蛋白质组的变化实验。与代谢结果一致，基于液滴式高压分选诱导了持续更显着的信号转导变化。
图6：蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学实验结果
Choudhury等人的研究结果显示，MACSQuant Tyto对分选细胞的影响明显较小，事实上，与采用液滴式分选的细胞相比，Tyto分选细胞与未分选的原始细胞更为相似。对于某些细胞代谢物，细胞可以在48小时内恢复，但并不是所有的代谢物都能恢复，而Tyto 分选的影响很小，细胞恢复得更快。值得注意的是，负面影响也可能仅仅是由于对细胞的一般处理。研究了许多不同的途径，即线粒体能量代谢、氧化还原代谢、氨基酸和脂质前体的合成以及磷酸化蛋白质组学，它们都受到液滴式分选的影响。与基于液滴式分选技术相比，基于微芯片的分选技术诱导了最小的细胞应激，并更好地保留了细胞代谢和磷酸化蛋白质组学状态，使其适用于脆弱的细胞制备和专注于代谢和信号传导的研究。研究同样表明，与液滴式细胞分选仪相比，基于微芯片的细胞分选是一种破坏性较小的分选技术，可以最大限度地减少分选过程中的细胞压力，提高下游研究的数据可靠性。