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选对流式抗体,流式实验不 NG
人阅读 发布时间:2022-06-15 09:41
抗体作为细胞生物学和生物化学中最重要的试剂之一,科学界每年在这类试剂上的花费约达 20 亿美元 [1]。但是我们经常会听到一些令人沮丧的结果---抗体不起作用,实验结果无法重复。
抗体的不可靠性给生物学研究(包括癌症,代谢,免疫学等)带来巨大的损失,尤其是流式实验过程,抗体的选择极其重要,可重复性差,特异性不足,批间差异性等均可导致错误结果和大量时间的浪费。但近年来,生物界对实验的可重复性越来越关注,传统抗体存在的问题凸显出来:
• 每使用一管新抗体都需要进行滴定测试,做不好还浪费抗体;
• 那么多种同型对照,是人是鼠傻傻分不清楚;
• 步骤复杂,一旦忘记加 Fc 阻断试剂,一切从头来过;
• 抗体不佳,阳性细胞群不明显,但样品珍贵,实验就地搁置;
• ……
2015 年 2 月份,瑞士苏黎世大学(University of Zurich)蛋白质工程学家 Andrew Bradbury,Andreas Plückthun 和来自世界各地的 110 名研究人员在 Nature 上共同倡议:抗体的生产应该标准化 [2]。像基因一样,抗体也应由它们的序列来定义,并且应该在细胞系中重组而成,而非通过动物免疫得到,这样才能保证抗体的标准化及实验的可重复性。有科学家提出:使用重组抗体 [1]。
重组抗体不同于传统抗体,无需通过动物源性的样本制备,由改造后的抗体基因序列直接在哺乳动物细胞中表达,细胞培养均在标准化,无血清的环境中进行。抗体的生产均在遗传背景完全相同的细胞系中表达,很大程度避免了表达系统不同而带来的抗体批次间质量差异性。
美天旎 REAfinityTM 重组抗体
——为流式而生
什么是 REAfinity 抗体?
REAfinity 抗体是一种重组基因工程改造抗体,是将传统的小鼠或大鼠杂交瘤来源的单克隆抗体的抗原结合区(Fab)与经过突变的人 IgG1 的恒定区(Fc)进行基因重组而成。
为什么说 REAfinity 抗体是为流式而生?
• 批次间稳定一致
REAfinity 重组抗体源于一段只编码一种重链和轻链的 DNA 序列,从而确保抗体的超高纯度。标准化的培养条件下,由哺乳动物细胞表达,保证了抗体质量的批次间稳定性。
图 2:对抗体进行质谱分析,数据表明:REAfinity 抗体纯度非常高,而杂交瘤来源的抗体是一种混合物。(A) 对两个杂交瘤来源的单克隆抗体样本进行质谱分析,可以看出,它们都含有一条分子量接近 23,635Da 的污染轻链。(B) 两个 REAfinity 抗体样本的质谱分析结果显示,其含有极高纯度的轻链。
• 通用型同型对照
所有的 REAfinity 抗体都是人 IgG1 亚型;因此,对于超过 1 万种 REA 克隆号的所有抗体来说,只需一种人 IgG1 同型对照。根据抗原表达位置不同,该通用型同型对照抗体分为膜表面型和胞内型两类,无需花费时间寻找合适的同型对照抗体。
图 3:使用 REAfinity 抗体时,只需一种通用型同型对照,降低了实验设计的复杂程度
• 无需 Fc 受体阻断
REAfinity 抗体 Fc 段经基因突变改造,从而消除了抗体与 Fcγ 受体的非特异性结合。因此,在流式分析中,无需额外增加阻断步骤。
• 优选序列,染色指数高
挑选最佳克隆号的抗体,以该抗体序列作为改造的基础,所以 REAfinity 抗体亲和力更高、特异性更好;REAfinity 抗体本身背景值低、抗体与荧光素结合的优良工艺,二者保证了抗体的高染色指数。
参考文献:
[1]Goodman SL. The antibody horror show: an introductory guide for the perplexed. N Biotechnol. 2018 Oct 25;45:9-13. doi: 10.1016/j.nbt.2018.01.006. Epub 2018 Feb 3. PMID: 29355666.
[2]Bradbury, A., Plückthun, A. Reproducibility: Standardize antibodies used in research. Nature 518, 27–29 (2015). https://doi.org/10.1038/518027a.