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外泌体检测鉴定技术新突破

人阅读 发布时间:2022-03-08 10:43

外泌体(exosomes)是来源于具有内吞作用的细胞外囊泡(EV),直径在 30~160 nm 的纳米级大小的膜融合形成的双层囊泡样结构,内含核酸(DNA、mRNA、microRNA、lncRNA 等)、蛋白质、脂质等生物大分子,表面具有特定的分子标志,如 CD9、CD63 和 CD81 等(图 1)[1]。几乎所有类型的细胞都能分泌外泌体,如:尿液、唾液、血液、腹水等均有外泌体存在。

 

图 1:细胞外囊泡和外泌体的特性和异质性

 

EVs(包括外泌体)可以包含细胞的许多成分,如 DNA、RNA、脂质、代谢物,以及细胞溶质和细胞表面蛋白质,但由于细胞类型,代谢状态,刺激物,母体细胞的病理状态的差异进而 EVs 内含物质也不同。外泌体作为一类细胞与组织间重要的信使,可运载众多信号分子,参与机体众多生理、病理活动(图 2)。在各种疾病中,外泌体提供了一个了解细胞或组织状态改变的窗口,它们在生物体液中的检测可能提供多组分诊断读数。在多种体液中稳定存在,且易于获取,对患者取样损伤小等优势,成为液体活检、肿瘤诊断和药物载体的理想生物样本。但外泌体的形成过程中,细胞在内陷过程中的不均一,加之胞内多囊泡体成熟过程中特异性蛋白的分选机制,导致外泌体在大小和内容物存在差异,使得外泌体具有显著的异质性,异质性的存在让外泌体鉴定变得尤为困难。

 

图 2:人体内具有多效性功能的细胞间转运系统
 

分离纯化后的外泌体,传统的方法多数采用理化性质进行检测鉴定:1)物理性质鉴定,对于外泌体的大小及浓度,采用纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)、动态光散射(dynamic light scattering,DLS) 和可调电阻脉冲传感(tunable resistive pulse sensing,tRPS)。对于外泌体的形态,采用扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)和透射电镜(transmission electron microscope, TEM)进行观察。2)生化性质鉴定,主要是针对外泌体所携带的特异性蛋白标志物的检测,采用蛋白质印迹法(Western blot)和纳米流式细胞术(nanoscale flow cytometry,Nano FACS) 两种方法。体液来源的外泌体,应用于临床疾病诊断和预后筛查,迫切需要解决的问题是标准化(分离纯化标准化和检测鉴定的标准化)。

 

外泌体分析新突破——基于流式的外泌体分析
 

流式细胞术可以对单个细胞或其他生物粒子进行多参数,快速的定量分析,无疑是外泌体研究的理想工具,但由于 EV 体积较小,难以利用标准的流式细胞术进行分析,阻碍了该领域的发展。为了便于全面分析 EV,美天旎研发出 MACSPlex 外泌体试剂盒(MACSPlex Exosome kit),该试剂盒使用了多种不同荧光标记的磁珠群体,这些 MACSPlex 外泌体捕获磁珠可通过流式细胞术来区分,实现 EV 检测的标准化。

Ÿ  独特的多重磁珠平台,可利用流式细胞术进行 EV 的蛋白表达谱分析

Ÿ  可同时筛选 37 种表面标志物,有助于节省宝贵的样本材料

Ÿ  可对细胞培养上清或体液中的 EV 进行分析


MACSPlex 外泌体捕获磁珠群体中的每个磁珠均可与特异性抗体偶联,这些抗体分别结合于不同的外泌体表位。使用 MACSPlex 外泌体检测试剂——即 APC 偶联的四次跨膜蛋白 CD9、CD63 和 CD81 抗体混合物,对与 MACSPlex 捕获磁珠结合的外泌体进行染色。形成的复合物包含 i) MACSPlex 外泌体捕获微珠、ii) 外泌体和 iii) APC 偶联抗体 (图 3)。

 

图 3:MACSPlex 外泌体试剂盒的原理
 

然后根据 MACSPlex 外泌体捕获微珠和 APC 偶联抗体的荧光特性对这些复合物进行分析(图 4)。该试剂盒中还包含两种同型对照微珠,用于检查非特异性结合。在 MACSQuant®流式分析仪上使用 Express 模式即可轻松进行分析。Express 模式简化了实验设置、执行和分析步骤,即便是缺乏流式细胞术经验的用户也可以进行复杂的外泌体分析。

 

图 4:采用 MACSPlex 外泌体试剂盒进行外泌体分析。该示例展示了 (A) 根据微珠大小设门,(B) 区分采用不同标记的微珠群体,以及 (C) 检测单个微珠群体的信号强度。

 

表 1:MACSPlex 外泌体试剂盒用于 EV 分析的表面标志物和对照抗体

 

参考文献:

[1] KalluriR, LeBleu VS. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 2020 Feb 7; 367(6478).

 

产品链接:https://www.biomart.cn/infosupply/103597500.htm

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